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cmpl在真性红细胞增多症患者骨髓CD34阳性细胞及血小板上的表达

发布时间 2015-08-21



【摘要】  本研究了解真性红细胞增多症(PV)患者血小板膜及骨髓CD34阳性细胞表面TPO受体(cmpl)蛋白及骨髓造血细胞cmpl mRNA表达情况。应用双色流式细胞术检测13例PV患者及15名正常对照者骨髓CD34阳性细胞表面cmpl蛋白表达;应用单色流式细胞术检测15例PV患者及15名正常对照者血小板表面cmpl蛋白表达;应用RTPCR方法检查PV患者及正常对照者骨髓造血细胞cmpl mRNA的表达情况。结果表明: CD34阳性细胞cmpl蛋白表达在PV患者为0.99%±0.14%,与正常对照(0.92%±0.12%)相比无差别(p>0.05);血小板cmpl蛋白表达在PV患者为20.33%±4.84%,与正常对照(23.50%±3.64%)相比无差别(p>0.05);骨髓造血细胞cmpl mRNA与正常组相比也无明显差别(p>0.05。) 结论: PV患者骨髓CD34阳性细胞、血小板膜cmpl蛋白及骨髓造血细胞cmpl的mRNA表达无明显异常。

【关键词】  真性红细胞增多症


    Expressions of cmpl Proteins on CD34+ Bone Marrow Cells and Platelets of the Patients with Polycythemia Vera

    BAI Jie, SHAO ZongHong1,  SHI Jun,  JIA HaiRong, SUN Juan

    Institute of Hematology and Blood Disease Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences  Peking Union Medical College,  300020 Tianjin, China; 1Department of Hematology, General Hospital, Tianjin Medical University, 300070 Tianjin, China

    Abstract    The objective of this study was to investigate the expressions of TPO receptor (cmpl) proteins on CD34 positive  bone marrow cells (CD34+ BMCs),  platelets   and  the expression of cmpl mRNA in bone marrow cells of the patients with polycythemia vera (PV). The expressions of cmpl proteins on CD34+ bone marrow hematopoietic cells  of 13 PV patients  and 15 normal controls were assessed by bicolor flow cytometry  and the expressions of cmpl proteins on platelets of 15 PV patients and 15 normal controls were assessed by monocolor flow cytometry, and the expressions of cmpl mRNA in bone marrow hematopoietic cells (BMHCs)  were assessed by RTPCR.  The results showed that no difference was found between the expression of cmpl proteins on CD34+  BMHCs   of PV patients(0.99%±0.14%) and that of normal controls (0.92%±0.12%)(p>0.05). There was no difference too between the expression of cmpl protein on platelets in PV patients(20.33%±4.84%) and that in normal controls (23.50%±3.64%)(p>0.05).  No difference between the expression of cmpl mRNA in BMHCs  of PV patients and that in normal controls  was seen. In conclusion, the expressions of cmpl proteins on CD34+ BMHCs,   platelets  and  cmpl mRNA in BMHCs of PV patients were not obviously abnormal.

    Key words    polycythemia vera;  platelet; bone marrow hematopoietic cell; CD34 positive;  cmpl

    J Exp Hematol 2007; 15(5):1061-1064

    真性红细胞增多症(PV)属骨髓性增殖性疾病(MPD),是由多潜能造血干祖细胞发生突变而引起的,其造血干祖细胞存在高增殖性及低凋亡性[1,2]。近年来的大量研究证实,PV造血祖细胞对多种细胞因子高度敏感[3-5],说明其造血细胞表面细胞因子受体或其信号传导系统可能存在异常,因此其造血干祖细胞表面细胞因子受体及PV信号传导系统的研究有助于对其发病机制的了解。

    PV患者红系祖细胞在不加外源性EPO时可以形成内源性红细胞集落(EEC)[6-8],但多项研究证明PV患者EPO受体及EPO与配体的亲和能力是正常的,未发现EPO受体基因的异常[9]。血小板生成素(TPO)是调节血小板生成的细胞因子,其构 型上有一个153个氨基酸的结构域与EPO相似。在体外TPO不但对巨核前体细胞而且对造血祖细胞的增殖分化均产生直接作用[10,11]。中国实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(5)cmpl在真性红细胞增多症患者骨髓CD34阳性细胞及血小板上的表达我们应用流式细胞术检测了15例PV患者及15名正常对照者血小板表面TPO受体(cmpl)。应用RTPCR方法检查PV患者及对照骨髓造血细胞cmpl mRNA表达情况,以阐明cmpl在PV发病机制中的意义。现将结果报道如下。

    材料和方法

    检测对象

    2002年1月至2003年10月在中国医学科学院血液病医院诊治的PV患者15例,正常对照15名。全部患者的诊断及疗效判定依据国内统一标准[12]。15例PV患者中11例为初诊未治疗患者,2例单纯放血治疗,2例应用羟基脲/干扰素治疗,平均治疗时间为7个月,停药2周以上且血象仍高于正常。15名正常对照,男9例,女6例,中位年龄47。15例PV患者的临床和检验指标见表1。

    试剂

    淋巴细胞分离液FacollPaque(1.077 g/ml)由中国医学科学院血液学研究所生产;兔抗人cmpl单克隆抗体由日本麒麟公司馈赠。FITC标记羊抗兔IgG购自美国Southern Biotech公司;PE标记的CD34、IgG1抗体试剂盒购自美国Becton Dickinson公司。RNA提取试剂(TRIZOLTM reagent)由Gibco公司生产;Taq plus聚合酶、cmpl引物,参照文献[6]设计,由上海生物工程有限公司合成;紫外分光光度计由美国Shimadzu公司生产;PCR扩增仪由美国FECETUS公司生产;紫外照相机购自日本Olympus公司;流式细胞仪(FACS) 由美国Becton Dickinson公司生产。

    骨髓CD34阳性细胞表面cmpl表达的检测

    取肝素抗凝新鲜骨髓200 μl,将人AB型血清加入新鲜骨髓,孵育5分钟,封闭非特异抗体。加入兔抗人cmpl IgG, 4℃避光孵育30分钟。用含0.5% BSA及0.6%柠檬酸钠的PBS液洗涤2遍,FITC标记的羊抗兔IgG,4℃避光孵育30分钟。加入PE标记的CD34单克隆抗体,避光4℃孵育45分钟。加入10%溶血素孵育10分钟,弃除溶血素,应用PBS洗涤2遍,加1%的多聚甲醛固定,24小时内应用流式细胞仪检测。1×106骨髓细胞加入FITC/PE标记的同型特异抗体同时孵育作为阴性对照。

    血小板表面cmpl表达的检测

    取3.8%的柠檬酸钠抗凝的新鲜静脉血5 ml,以1 600×g离心10分钟,吸取取富含血小板的血浆,再以7 500×g离心12分钟,将待测血小板用含0.5% BSA及0.6%柠檬酸钠的PBS液洗涤2遍。取1×109血小板,再用含0.5% BSA及0.6%柠檬酸钠的PBS液洗涤2遍,1小时内应用流式细胞仪检测。

    cmpl表达的RTPCR法检测

    取(5-10)×106骨髓单个核细胞,应用TRIZOL一步法抽提取总RNA后应用紫外分光光度计测定其浓度和纯度。Cmpl引物序列如下: cmpl上游引物 5'CCTACTGCTGCTAAAGTGGCAAT3'; 下游引物 5'CAATAGCTTAGTGGTAGGTAGGA 3'。 

    PCR体系50 μl,含待测DNA 2 μl, 2.5 mmol/LdNTP 1 μl, Taq plus聚合酶2.5 U,10×缓冲液5 μl, 10 mmol/μl上游引物及下游引物各2.5 μl,加无菌双蒸水至50 μl。使用PCR扩增仪(FECETUS公司)扩增。Cmpl的PCR条件参考文献[13]为: 94℃预变性7分钟,94℃变性45秒,52℃退火45秒,72℃延伸45秒,72℃再延伸5分钟,共35个循环。取10 μl扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,电压10 V/cm。应用紫外照相机(日本Olympus公司)记录结果。PCR的扩增长度应为548 bp(βactin)、368 bp(cmpl)。

    统计学方法

    率的比较采用Pearson 卡方检验或Fisher精确概率法分析;均数比较采用t检验;皆用SPSS软件处理。

    结    果

    骨髓CD34阳性细胞表面cmpl表达

    骨髓CD34阳性细胞表面cmpl表达在PV患者为0.99%±0.14%,与正常对照(0.92%±0.12%)相比无差别(p>0.05)(表2)。

    血小板表面cmpl表达

    血小板表面cmpl蛋白表达在PV患者为20.33%±4.84%,与正常对照(23.50%±3.64%)相比无差别(p>0.05)(表2)。

    cmpl mRNA表达

    骨髓造血细胞cmpl mRNA 在PV患者检出率为46.7%(7/15)与正常组40%(6/15)比较无明显差别(附图)。

  讨    论

    近年来人们重视到PV患者巨核细胞集落(CFUMK)对TPO高度敏感。即PV的造血干、祖细胞(CD34+细胞)在没有TPO条件下能够形成CFUMK。因此人们认为TPO介导的信号传导系统异常可能与PV发病有关[14]。

    有人报道敲除小鼠TPO受体(cmpl)时,多潜能造血干细胞和髓系、红系定向祖细胞数均减少。若小鼠cmpl过度表达,可导致过度造血和骨髓纤维化。cmpl异位表达可引起致命的红细胞增多症。应用带有截短的cmpl基因的髓系增殖性白血病病毒(MPLV)可诱导大鼠红细胞、血小板、粒细胞增多及脾大。在体外用MPLV转染造血细胞,可使造血祖细胞不依赖于生长因子而形成红细胞集落[15]。缺乏EPO受体的胚胎中,TPO可使红细胞集落形成[6],且可以阻止去EPO受体的红系祖细胞凋亡[16]。

    Dai等[3,4]报道,34名PV患者血小板均缺失cmpl,缺失cmpl血小板与TPO共孵育,不能激活JAK2/TYK2,以至于STAT5不能进行酪氨酸磷酸化。他们应用C末端mpl抗血清证明了PV患者中cmpl翻译后加工过程受损。mpl胞浆外结构域第4位点缺乏翻译后糖化修饰,并认为这与其细胞内高尔基器运输缺陷有关。

    Muta等[5]应用免疫杂交方法得出了不同的结论。他们发现,15名PV患者中有8名cmpl表达水平减低,而7名表达正常。他们认为cmpl表达水平及其功能完整性在PV患者存在异质性。


    在本研究中我们发现,CD34阳性细胞、血小板表面cmpl蛋白表达及骨髓造血细胞cmpl mRNA表达在PV患者与正常对照者中均无差别。这表明PV患者高增殖和低淍亡与cmpl无关,可能与细胞因子信号传导系统共同通路有关。

【参考文献】
  1白洁, 邵宗鸿, 刘鸿等. 真性红细胞增多症患者骨髓CD34阳性细胞淍亡及增殖特征研究. 中华血液学杂志,2004;25:195-197
2白洁, 邵宗鸿, 刘鸿等. 真性红细胞增多症患者骨髓CD34阳性细胞凋亡相关蛋白的表达. 中华血液学杂志,2004;25:617-620
3Dai CH, Krantza SB, Green WF, et al. Polycythemia vera Ⅲ. Burstforming usintserythroid(BFU-E) response to stem cell factor and ckit receptor expression. Br J Haematol, 1994; 86: 12-21
4Coorrea PN, Eskinazi D, Axelrad AA, et al. Circulating erythroid progenitors in polycythemia vera are hypersebsitive to insulinlike growth factor in vitro: studies in an improved serumfree medium. Blood, 1994; 83: 99-112
5Muta K, Krantz SB, Bondurant MC, et al. Distinct roles of erythropoietin, insulilike growth factor 1, and stem cell in the development of erythroid progenitor cells. J Clin Invest, 1994; 94: 34-43
6Spivak JL, Pham T, Isaac M, et al. Erythropoietin is both a mitogen and a survival factor. Blood, 1991; 77: 1228-1233
7Bai J, Shao ZH, Liu H, et al. Endogenous erythroid colony assay in patients with polycythemia vera and its clinical significance. Chin Med J(Engl), 2004; 117 :668-672
8白洁, 邵宗鸿, 刘鸿等. 真性红细胞增多症患者内源性红系集落的检测及其临床意义. 中华血液学杂志,2003;24:561-564
9LeCouedic JP, Mitjavila MT, Villeval JL, et al. Missense mutation of the erythropoietin receptor is a rare event in human erythroid malignancies. Blood, 1996; 87:1502-1511
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11Ratajczak MZ, Ratajczak J, Marlicz W, et al. Recombinant human thrombopoietin( TPO ) stimulates erythropoiesis by inhibiting erythroid progenitor cell apoptosis. Br J Haematol, 1997;98: 8-17
12张之南,沈悌. 血液病诊断及疗效标准. 北京:科学出版社, 1998. 141
13Xie X, Chan RJ, Johnson SA, et al. Thrombopoietin promotes mixed lineage and megakaryocytic colonyforming cell growth but inhibits primitive and definitive erythropoiesis in cells isolated from early murine yolk sacs. Blood, 2003; 101: 1329-1335
14DAMON A, HOLUB DA. Host factors in polycythemia vera. Ann Intern Med, 1958; 49:43-60
15Caldwell GG, Kelly DB, Heath CW, et al. Polycythemia vera among participants of a nuclear weapons test. JAMA, 1984; 252: 662-664
16Kralovics R, Indrak K, Stopka T, et al. Two new EPO receptor mutations: truncated EPO receptors are most frequently associated with primary familial and congenital polycythemias. Blood, 1997; 90: 2057-2061

 

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